Диссертация: Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

aОтносительная транскрипционная активность, % от уровня транскрипции соответствующего гена домашнего хозяйства.

Пожалуй, наиболее интересным результатом анализа химер грибов оказалось то, что смена матрицы проходит только по специфическим нуклеотидным позициям в составе исходной РНК. 3' концевые части химер, как правило, сформированы фрагментами MGL LINE. Длина этих фрагментов варьирует от 230 до 5461 3'-концевых нуклеотидов MGL. Анализ последовательностей 33 химер позволил картировать 28 различных точек химеризации в составе последовательности MGL. В шести случаях, одна и та же точка использовалась при образовании двух различных элементов. То есть, смена матриц осуществлялась по одной и той же нуклеотидной позиции РНК-матрицы в ходе формирования шести пар химер. Анализ 28 точек химеризации показал, что они расположены не случайным образом в составе РНК MGL (таблица 1.4.6).

Точки смены матрицы соответствовали особому мотиву нуклеотидной последовательности, который присутствовал также и в точках химеризации в составе Mg-SINE. Всем им соответствовала консенсусная последовательность GCC*A/U, где * обозначает участок возможной смены матрицы. Обратная транскриптаза MGL копирует матрицу до нуклеотида A/U в составе мотива, где она может «перепрыгнуть» на другую РНК перед триплетом GCC.

Таблица 1.4.6. Репрезентативные точки химеризации, найденные в геноме M. grisea

aДетальное описание химер дано в работе (285).

bТип РНК-матрицы.

cВышележащая нуклеотидная последовательность относительно участка смены матрицы.

dНижележащая нуклеотидная последовательность относительно участка смены матрицы.

Надо заметить, что РНК полноразмерного MGL имеет 87 мотивов GCC(A/U) и гораздо больше - участков с однонуклеотидными заменами, тогда как только лишь небольшая их часть используется при химеризации in vivo. Учитывая, что шесть таких сайтов являются “горячими точками” РНК рекомбинации, очевидно, что наличие мотива необходимо, но не достаточно для смены матрицы. Мы постулировали, что точки химеризации расположены в структурированных участках РНК-матрицы. Такие участки могут быть труднопроходимы для ОТ. Похожая ситуация наблюдается для химер млекопитающих, где многие точки химеризации примерно соответствуют наблюдаемым участкам паузы ОТ (301, 312). В согласии с выдвинутой гипотезой, In silico вокруг точек химеризации в геноме гриба были предсказаны участки выраженной вторичной структуры РНК (Предсказанные структуры размещены в Интернет по адресу:

http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-2164-8-360-s2.doc.

Остаётся неясным, почему ОТ диссоциирует непосредственно перед триплетом GCC. Для многих ОТ известно, что их процессивность зависит от нуклеотидного состава РНК-матрицы. Можно предположить, что мотив GCC, в особенности находящийся в составе шпильки, является труднопроходимым местом для ОТ MGL, что может приводить к временной остановке фермента в этом месте или же к диссоциации и смене матрицы.

В заключение следует упомянуть, что вышеуказанный механизм химеризации не включает какого-либо специфического спаривания нуклеотидов между новосинтезированной кДНК и второй РНК-матрицей, поскольку никаких участков микро- или протяжённых гомологий между ними обнаружено не было.

Тройные химеры и уточнение схемы образования химерных элементов

Обнаруженный в нашей работе тройной элемент грибов (Рис. 1.4.11) доказывает, что в ходе LINE-опосредованной РНК рекомбинации in vivo может происходить более чем один акт смены матрицы. Наиболее вероятным механизмом образования тройных химер является двойная смена матрицы при ретротранспозиции LINE (Рис. 1.4.12). Скопировав 3'-концевые 4369 нуклеотидов MGL LINE (полная длина MGL составляет ~6 т.п.н.), ретропозиционный комплекс переключается на другую РНК и добавляет к кДНК ~350-нуклеотидный 3'-концевой фрагмент элемента Mg-SINE.

Затем, не закончив синтез комплементарной цепи Mg-SINE, ОТ меняет матрицу во второй раз и прибавляет к двухчастной кДНК ещё и полноразмерную копию WEIRD (1113 нуклеотидов). После лигирования химеры и репарации геномной ДНК, элемент оказывается фланкирован 14-нуклеотидными прямыми повторами - дупликациями преинтеграционного сайта.

Рисунок 1.4.11. Схема обнаруженных тройных элементов из геномов M.grisea (A), человека (Б) и мыши (В). Только элементы гриба и мыши фланкированы прямыми повторами и, соответственно, могут, рассматриваться как тройные химеры.

Ранее в геноме человека были найдены два тройных элемента (282, 284) (Рис. 1.4.11). Один из них интегрирован в протяжённый микросателлитный локус, другой - в АТ-богатую последовательность. Поэтому идентифицировать прямые повторы для них не удалось.

Однако же, в геноме мыши были обнаружены два новых тройных химерных ретроэлемента, фланкированных 15- и 16-нуклеотидными прямыми повторами (Рис. 1.4.11). Химеры состояли из блоков B2 SINE, U6 мяРНК и L1 LINE. Тройные химеры в геномах таких эволюционно отдалённых организмов, как млекопитающие и нитчатые грибы свидетельствуют, что двойные акты смены матрицы в ходе обратной транскрипции LINE, возможно, являются не исключением, а консервативным механизмом перестройки эукариотической ДНК.

Рисунок 1.4.12. Механизм образования химер при помощи энзиматического аппарата LINE. (1) преинтеграционный комплекс LINE связывает РНК LINE, SINE или другую РНК в цитоплазме. (2) Рибонуклеопротеид транспортируется в ядро. (3) Обратная транскрипция связанной РНК, праймированная одноцепочечным разрывом в геномной ДНК (target site primed reverse transcription). (4A) Успешная интеграция кДНК в геномную ДНК. (4B) Смена матрицы на другую РНК в ходе обратной транскрипции. (5A) Интеграция двойной химеры в геномную ДНК. (5B) Вторая смена матрицы на другую РНК с последующей репарацией ДНК приводит к образованию интеграции тройного химерного ретроэлемента, фланкированной прямыми повторами. Нормальная последовательность событий при ретротранспозиции LINE: (1)- (2)- (3)- (4A).

2. Анализ транскрипционной активности геномных повторов

Работа по этому проекту выполнялась группой исследователей, включающей Е.В.Гогвадзе, Е.А.Ковальскую-Александрову, Т.В.Чалую, Е.Д.Свердлова, а также А.А.Буздина. Основной объём экспериментальной работы был выполнен Е.А.Ковальской-Александровой и Е.В.Гогвадзе, общее руководство работой осуществлял Е.Д. Свердлов, идея метода GREM, его разработка и выбор объекта - заслуга диссертанта.

2.1 Введение

Повторяющиеся элементы образуют значительную часть большинства эукариотических геномов, и крупномасштабные исследования их транскрипционной активности привлекают всё больший интерес. Многие геномные повторы появляются при встройках мобильных элементов. Ретроэлементы, представители мобильных элементов, которые размножаются посредством своих РНК-копий, это единственная транспозиционно активная группа мобильных элементов у млекопитающих. В ДНК позвоночных, ретроэлементы занимают 30-40% всего генома (50, 313-315). Являясь мобильными переносчиками модулей транскрипционной регуляции, ретроэлементы могут изменять регуляцию активности генов хозяина, в частности, генов, вовлечённых в эмбриональное развитие, что делает их вероятными кандидатами на роль участников процесса видообразования (316).

Недавно было показано, что ретроэлементы могут направлять транскрипцию соседних уникальных последовательностей генома хозяина (317, 318). Многие типы геномных повторов транскрибируются in vivo (319, 320). Однако же, значительная доля таких экспрессирующихся повторов является частью транскриптов большего размера, считываемых с вышележащих геномных промоторов. Обычные и популярные методы анализа транскриптома, такие, как ОТ-ПЦР, дифференциальный дисплей (102, 321), вычитающая гибридизация (11, 12, 77), серийный анализ генной экспрессии (SAGE) (322) и микрочиповая гибридизация, не позволяют проводить различия между транскриптами, насквозь прочитанными с вышележащих промоторов, и теми, которые обязаны собственной транскрипционной активности геномных повторов. Различные модификации метода 5' RACE (англ. rapid amplification of cDNA ends - быстрая амплификация концов кДНК) позволяют точно находить участки старта транскрипции (257), но не могут быть использованы для количественного и крупномасштабного скрининга транскрипционной активности. Нашей целью являлась разработка полно-транскриптомной стратегии, которая позволяла бы проводить исчерпывающие исследования собственной промоторной активности повторяющихся элементов. Для этого мы постарались комбинировать преимущества, предоставляемые техникой 5'-RACE и методами гибридизации нуклеиновых кислот.

В нашей группе был разработан метод, названный GREM (Genomic Repeat Expression Monitor), основанный на гибридизации тотальных пулов 5'-концевых частей кДНК с полногеномными пулами ДНК, фланкирующей повторяющиеся элементы, с последующей селективной ПЦР амплификацией получающихся гибридных дуплексов геномной ДНК и кДНК. Библиотека гибридных молекул кДНК\геномной ДНК, полученная таким образом, может использоваться как набор маркеров для индивидуальных транскрипционно активных повторов. Метод является как качественным, так и количественным, поскольку частота встречаемости тех или иных маркёров пропорциональна промоторным активностям соответствующих им повторяющихся элементов.

Мы применили GREM для полногеномной идентификации промоторно-активных эндогенных ретровирусов, специфичных для ДНК человека (чсЭРВ). Как было указано выше, HERV-K (HML-2) - это единственное семейство эндогенных ретровирусов, содержащее членов, уникальных для генома человека (251, 261). Эта группа, члены которой не только сохранили свою транскрипционную активность (323) , но, возможно, по-прежнему обладают некоторым инфекционным потенциалом (263, 324), является одной из наиболее биологически активных ретровирусных семейств генома человека (325-327). Основная часть ЭРВ претерпела гомологичную рекомбинацию по последовательностям своих LTR, так что в настоящее время это семейство представлено, в основном, одиночными LTR (254, 328). Как указывалось выше, чс LTR обладают значительным сходством первичной последовательности и образуют отдельное семейство (названное HS) (251, 261). HS семейство характеризуется диагностическими нуклеотидными заменами по ряду позиций своей консенсусной последовательности (251). Семейство HS на 86% состоит из последовательностей, уникальных для генома человека, и содержит 156 последовательностей. HS-семейство представлено фрагментами полноразмерных провирусов HERV-K (HML-2) (11.5% представителей), делетированных провирусов (5.2%), или одиночных LTRs (83.3%). Ниже будет детально описан метод GREM и результаты, полученные при помощи этого экспериментального подхода для характеристики транскрипционной активности чсЭРВ in vivo.

гибридизация нуклеиновый кислота последовательность

2.2 Метод GREM: полногеномный поиск промоторно-активных повторов

Особенности метода GREM. Насколько мне известно, GREM (Genomic Repeat Expression Monitor) является единственным на сегодняшний день полно-транскриптомным подходом, позволяющим детально исследовать собственную промоторную активность повторяющихся элементов и отбросить фон «сквозной» транскрипции через последовательность повтора. Получаемая при помощи GREM клонотека может использоваться как набор маркёров индивидуальных транскрипционно активных повторяющихся элементов. GREM объединяет преимущества метода 5' RACE и гибридизации нуклеиновых кислот. Метод основан на том, что промоторно-активные геномные повторы инициируют транскрипцию со своих собственных внутренних последовательностей, так что соответствующие транскрипты содержат фрагмент последовательности повтора на своих 5'-концах. Это выполняется для всех основных классов ретроэлементов: LTR-содержащих, LINE и SINE (269, 329, 330). Поэтому мы старались специфично выделить фракцию транскриптов, содержащих последовательность повтора на 5' конце. Было показано, что количество индивидуальных маркёров в библиотеке пропорционально содержанию мРНК, считываемой с соответствующего промоторно активного повтора. В наших модельных экспериментах, GREM использовался для полногеномного исследования особенностей транскрипционной активности LTR семейства HS в клетках зародышевого пути человека (паренхима яичка) и в соответствующем злокачественном новообразовании (семинома).

Транскрипция LTR полноразмерного провируса может приводить к образованию двух видов продуктов: РНК вирусных генов (если инициируется на 5' LTR, см. Рис.2.2.1), либо, в случае промоторной активности 3' LTR, РНК уникальных не-вирусных последовательностей, которые фланкируют провирус с 3' конца.

Рис. 2.2.1. Схема транскрипционной активности одиночных (слева) и провирусных (справа) LTR. Транскрипция с провирусного 5' LTR даёт РНК вирусных генов, тогда как экспрессия одиночных или 3' провирусных LTR приводит к транскрипции геномных последовательностей хозяина, фланкирующих 3' конец ретроэлемента.

Метод GREM, схематично представленный на Рис. 2.2.2, состоит из трёх основных стадий: (1) синтез полноразмерной библиотеки кДНК, молекулы которой несут специфическую маркёную последовательность, введённую на 5' конец кДНК, (2) селективная ПЦР-амплификация геномных последовательностей, фланкирующих повтор, и (3) гибридизация кДНК и фрагментов, фланкирующих повторы, с последующей ПЦР-амплификацией гетеродуплексов геномной ДНК\кДНК.