Диссертация: Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

Почему копии ядрышковых РНК так часто встречаются в составе химер?

5'- концевые части химер соответствуют ДНК-копиям ядрошковых РНК, тогда как 3'- концевые части являются копиями цитоплазматических РНК, включая транскрипты LINE. 3' концевые части - это в основном (> 80%) копии 5'-укороченных LINE (Табл. 1.4.3). Впрочем, в 12-20% химер 3' часть соответствует либо псевдогенам различных белок-кодирующих мРНК, либо ретропозонам SINE. В геномах млекопитающих, 5'-концевые части относятся в основном к псевдогенам, кодирующим малые ядерные РНК (мяРНК), включая U6 (82- 93%), U3 (1-10%) и U5 (0-1%). Другие псевдогены, встречающиеся с низкой частотой на 5'-конце - относящийся к SINE ретроэлемент Alu (0-2%), 7SL РНК (0-1%) и 5S рибосомная RNA (3- 6%). Все эти РНК характеризуются ядрышковой локализацией. U3 мяРНК вовлечена в процессинг рибосомной РНК в ядрышке (297). Хотя U5 и U6 как правило находятся вне ядрышка, в составе сплайсосом, но их созревание происходит именно в ядрышке (U6-2'-O-метилирование и псевдоуридилирование нуклеотидов) (298). РНК 7SL и Alu процессируются в ядрышке (299), так же как 5S рРНК (процессинг пре-рРНК). К сожалению, клеточная локализация РНК, соответствующей 5'-концу химер MINE из генома гриба M. grisea, пока так и не была установлена.

5'-конец MINE образован полноразмерной копией некодирующего транскрипта неизвестной функции длиной 1.1 т.п.н., названного WEIRD, который конститутивно экспрессируется на высоком уровне (296). Ген, кодирующий U6 мяРНК, был идентифицирован в геноме M. grisea, но он оказался не связан с какими-либо химерными элементами (неопубликованные данные). 3'-часть MINE соответствует 5'-укороченным копиям относящегося к LINE ретротранспозона MGL (296). Поскольку MINE элемент структурно чрезвычайно похож на химеры млекопитающих, можно предположить, что РНК-прообраз его 5' части (WEIRD), также локализуется в ядрышке, либо ассоциирована с рибонуклеопротеидами или РНК элемента MGL.

Преобладание копий именно ядрышковых РНК на 5' концах химер млекопитающих свидетельствует, что по крайней мере некоторые фазы жизненного цикла LINE связаны с ядрышком. В полном соответствии с этой гипотезой, Гудиер и соавторы (300) показали, что оба белка, кодируемых LINE человека (ORF1p и ORF2p) накапливаются в ядрышке. Авторы идентифицировали функциональный сигнал ядерной локализации в составе ORF2p (ОТ/интеграза) и установили, что ORF2p локализуется в ядрышках культивируемых клеток. ORF1p в основном находился в цитоплазме, но в некоторых клетках помимо цитоплазмы этот белок накапливался также и в ядрышках, колокализуясь с ORF2p. Таким образом, в ядрышке с высокой вероятностью можно ожидать и присутствия РНК LINE, связанной с белками ORF1p и ORF2p в рибонуклеопротеидный комплекс.

Впрочем, обратная транскрипция LINE точно не может быть ограничена ядрышком. В противном случае, большинство LINE были бы интегрированы в состав генов рибосомных РНК, которые и являются центрами формирования ядрышек. В реальности такой колокализации не наблюдается (273).

Вторая гипотеза постулирует, что некоторые ядрышковые РНК могут осуществлять защитную роль, препятствуя размножению LINE в геноме. Поскольку 3'- концевые LINE всегда соответствовали оборванным с 5'-конца копиям полноразмерных ретротранспозонов, то химеры могли бы быть образованы в результате неудачных актов ретротранспозиции. Согласно этой теории, укороченность с 5'-конца свежеинтегрированных LINE может быть следствием атак некоторых РНК на ретротранспозиционный комплекс. Гипотеза хорошо согласуется с тем фактом, что U6 мяРНК является ключевым атакующим компонентом сплайсосомы, который может воздействовать на другие РНК. Как показано для трёх геномов млекопитающих, характер распределения участков обрыва интегрированных копий укороченных одиночных LINE и LINE в составе химер практически полностью совпадал (Рис. 1.4.9). Примечательно, что ОТ L1 LINE характеризуется по крайней мере пятью участками в составе РНК L1, где этот фермент делает паузы (301). Эти участки совпадают с некоторыми «горячими точками» обрыва LINE и химеризации (Рис. 1.4.9).

Рисунок 1.4.9. Сопоставление частот 5'-обрыва и частот химеризации вдоль последовательностей L1 млекопитающих. Серые колонки показывают частоты 5'-обрывов L1 на 100 нуклеотидов, частоты химеризации показаны чёрным (масштабные отрезки даны слева). Для всех трёх исследованных геномов видна кокластеризация участков обрыва и химеризации в 3'-концевой части L1. Точки химеризации всех L1-содержащих химер млекопитающих сопоставляли с участками обрыва для случайно отобранных 250 человеческих, 350 мышиных и 210 крысиных L1. Стрелками показаны участки транскрипционных пауз, обнаруженные для ОТ L1 человека при обратной транскрипции матрицы L1 in vitro.

В экспериментах in vitro с ОТ LINE R2 было показано, что смена РНК-матрицы могла происходить лишь в случае, когда ОТ достигала 5' конца исходной РНК-матрицы (293). Если это верно и для ОТ L1, то смена матрицы и образование химерных ретроэлементов возможны только на 5' конце исходной РНК. Иными словами, РНК-матрица, соответствующая 3' концевой части химеры, в этом случае должна быть никирована или повреждена.

Ранее уже сообщалось, что 5' -укороченные РНК LINE человека и мыши могут образовываться in vivo в результате сплайсинга (302).

Третья гипотеза, по-видимому, наиболее реалистичная, объясняет присутствие рибонуклеопротеидов LINE в ядрышке необходимостью модификации их РНК, что может требоваться для активации ретротранспозиции (300). Эта гипотеза во многом базируется на том факте, что многочисленные модификации РНК осуществляются именно в ядрышке, причём многие такие модификации пока остаются неохарактеризованными. Кроме того, ядрышко может быть тем клеточным компартментом, где осуществляется окончательная сборка рибонуклеопротеидного комплекса LINE, аналогично тому, что было показано для некоторых ретровирусов (303). Обнаружение функционального консервативного сигнала ядрышковой локализации в составе ОТ LINE млекопитающих подкрепляет эту гипотезу (276). Ранее предполагалось, что рибонуклеопротеидный комплекс LINE пре-формируется в цитоплазме, а затем проходит в ядро. Согласно обсуждаемой гипотезе, этот комплекс далее переносится в ядрышко, где происходит его окончательная сборка и созревание. При созревании, некоторые распространённые ядрышковые РНК могут быть случайно захвачены рибонуклеопротеидом LINE, особенно его РНК-связывающим белком ORF1p. Затем созревший ретротранспозиционный комплекс выходит из ядрышка и ассоциирует с геномной ДНК, где и происходит сопряжённая обратная транскрипция. На этой стадии, с небольшой частотой могут происходить обратно-транскрипционные паузы (301). Паузы могут сопровождаться диссоциацией ОТ с исходной РНК-матрицы, в результате чего появляется новая 5'-укороченная копия LINE, или же может происходить «перескок» ОТ на новую РНК-матрицу, захваченную рибонуклеопротеидом LINE в ядрышке, при этом образуется химерный ретроэлемент. Гипотеза объясняет высокую частоту химеризации с последовательностями U6 как следствие высокой аффинности к ней РНК-связывающего белка LINE. Действительно, для U6 ранее была показана высокая аффинность к белкам Gag различных ретровирусов и LTR ретротранспозонов. Помимо прочего, эти белки являются шаперонами нуклеиновых кислот, функционально близкими белку LINE ORF1p (304), и молекулы U6 даже часто захватываются ретровирусными частицами (305, 306).

Некоторые особенности химерных ретроэлементов грибов

Семейство химерных ретроэлементов MINE из генома гриба Magnaporthe grisea уже упоминалось выше (296). 5'-концевые части MINE соответствуют полноразмерной копии некодирующего транскрипта неизвестной функции длиной 1.1 тпн, называемого WEIRD. 3' -концевая часть MINE соответствует 5'-укороченым копиям MGL LINE грибов (296). Инсерция одной копии MINE произошла буквально на глазах у исследователей, так что механизм образования химер у грибов активен и в настоящее время (296, 307). Систематический анализ геномных баз данных выявил для M. grisea 31 такой химерный ретроэлемент.

Как уже указывалось выше, функция РНК WEIRD пока остаётся неизвестной. В серии экспериментов по гибридизации in situ с зондами, специфичными для WEIRD, внутриклеточную локализацию WEIRD установить нам не удалось из-за чрезвычайно низкой проницаемости клеточной стенки M. grisea. При этом при помощи количественной ОТ-ПЦР был показан высокий уровень экспрессии WEIRD относительно двух генов домашнего хозяйства на всех стадиях жизненного цикла гриба. Содержание WEIRD в клетках сравнимо с РНК гена домашнего хозяйства Ilv5 (35, 20 и 61% от уровня транскрипции Ilv5 на различных стадиях). WEIRD экспрессируется дифференциально, причём повышенный уровень её содержания показан при инфекции гриба в растение (2-кратное превышение относительно содержания WEIRD в мицелии, Табл. 1.4.4). В то же время, ретротранспозон MGL транскрипционно более активен в спорах гриба.

Таблица 1.4.4. Транскрипционная активность WEIRD и MGL относительно уровней экспрессии генов Ilv5 и Ef1

aОтносительная транскрипция, % относительно уровня транскрипции соответствующего гена домашнего хозяйства.

Биоинформатический анализ показал, что WEIRD не является мобильным элементом, поскольку все геномные копии этой РНК были объединены с MGL LINE в составе химерных ретроэлементов. Одиночных копий WEIRD найдено не было. Отсутствие исходного гена WEIRD в базах данных, по-видимому, связано с незавершённостью проекта по секвенированию генома M. grisea (308). В других геномах также не было найдено последовательностей, гомологичных WEIRD.

Таким образом, WEIRD (1) не является мобильным элементом, (2) экспрессируется на всех стадиях жизненного цикла и (3) не кодирует белок. Это позволяет предположить, что WEIRD может являться функциональной конститутивной некодирующей РНК.

Помимо 31 MINE, в геноме M. grisea был найден также новый двухчастный химерный элемент, состоящий из копии WEIRD, объединённой с 5'-укороченным ретротранспозоном Mg-SINE. Химера WEIRD-MgSINE фланкирована прямыми повторами длиной 12 пар нуклеотидов. Mg-SINE - это неавтономный ретроэлемент, относящийся к группе SINE (309). Для размножения в геноме он использует стратегию “молекулярной мимикрии” относительно последовательности MGL. 3' конец Mg-SINE гомологичен 3' концевому фрагменту MGL, который используется для праймирования обратной транскрипции (310, 311). По-видимому, это свойство Mg-SINE обуславливает его узнавание ретропозиционным аппаратом MGL.

Кроме того, нам удалось обнаружить химерный элемент, состоящий из трёх частей (Рис. 1.4.11). На 5' конце располагалась полноразмерная копия WEIRD, объединённая с 5'-укороченным Mg-SINE, который, в свою очередь, был объединён с 5'-укороченным MGL. Химера фланкирована прямыми повторами длиной 14 пар нуклеотидов, что доказывает одновременную интеграцию в геном всех её компонентов.

В серии ОТ-ПЦР экспериментов мы показали, что многие химерные элементы грибов транскрибируются. Для этого проводилась амплификация с праймерами, специфичными для MINE: один на 5'-концевую часть WEIRD (в прямой ориентации), а другой - на 3' концевой участок MGL (в обратной ориентации; Рис. 1.4.10). Некоторые MINE экспрессировались в мицелии, спорах и при инфекции. Секвенирование ОТ-ПЦР продуктов позволило идентифицировать три транскрипционно активные копии MINE: MINE-A (полосы 1 и 5), MINE-B (полосы 2 и 4) а также MINE-C (полоса 3) (коды доступа в GenBank EF585235-EF585237).

Рисунок 1.4.10. Транскрибируемые химеры MINE, найденные на разных стадиях жизненного цикла M. grisea. Продукты nested ОТ-ПЦР разделяли в агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. Стрелки внизу обозначают сайты посадки праймеров Продукты ОТ-ПЦР выделяли из геля и секвенировали (полосы 1-5, в середине). Для дальнейшей специфической амплификации каждого индивидуального химерного элемента в ходе количественной ОТ-ПЦР, использовалась комбинация праймеров q1+q2. Каждый праймер q1 специфичен участку стыка WEIRD-MGL для исследуемого элемента MINE.

На самом деле, транскрибируемых химер, по-видимому, больше, чем три, поскольку многие такие элементы обладают длинными частями, сформированными MGL (до 5 т.п.н.), которые не могут быть эффективно амплифицированы в ходе ОТ-ПЦР. Для определения уровня транскрипции обнаруженных экспрессирующихся MINE, провели ряд количественных ОТ-ПЦР экспериментов с праймерами, специфичными для стыков WEIRD-MGL (праймеры q1 и q2 на рисунке 1.4.10). Результаты приведены в таблице 1.4.5. MINE-A, MINE-B и MINE-C на разном уровне транскрибируются на всех исследованных стадиях жизненного цикла гриба.

MINE-B экспрессируется конститутивно на всех стадиях, тогда как MINE-A и MINE-C более активны при инфекционном проросте, что совпадает с данными, полученными ранее для WEIRD, а в спорах транскрипция MINE-A понижена (x 0.5 относительно мицелия). Дифференциальная транскрипционная активность химер может отражать выполнение ими какой-либо функциональной нагрузки в клетках гриба.

Таблица 1.4.5. Экспрессия MINE-A, -B и -C относительно генов домашнего хозяйства Ilv5 и Ef1