Диссертация: Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

Рис. 2.2.2. Схема метода GREM (детальное описание дано в тексте). Протокол включает три основные стадии: (1) полногеномная амплификация 3'-концевых геномных фланков исследуемой группы повторяющихся элементов (на данном примере, HS LTR). Обработка получившегося ампликона экзонуклеазой ExoIII образует 5'-выступающие концы, которые пригодятся на третьей стадии. (2) Синтезируется олиго (Т)-затравленная библиотека кДНК из интересующей ткани (тканей). На этой стадии, в кДНК вводится последовательность линкерного олигонуклеотида (CS) непосредственно по позиции транскрипционного старта РНК, при помощи эффекта “cap-switch”. кДНК фрагментируется рестриктазой AluI, которая не имеет сайтов узнавания в составе последовательности HS LTR. Эта манипуляция предотвращает последующую амплификацию последовательностей LTR, транскрибируемых «насквозь» с вышележащих промоторов. (3) Наконец, ампликон геномной ДНК (стадия 1) гибридизуют с 5' -маркированной кДНК (стадия 2). Выступающие концы ДНК заполняются ДНК полимеразой, а получившиеся гибриды геномной ДНК\кДНК (ELT) амплифицируются в ходе nested ПЦР с праймерами, специфичными для адаптора, фланкирующего геномную ДНК, и для маркёрной последовательности, введённой на 5' конец кДНК.

Первая стадия GREM нацелена на амплификацию полноразмерных молекул кДНК, маркированных с 5' конца введённой последовательностью адапторного олигонуклеотида (CS в нашем случае). Такое мечение достигается благодаря применению эффекта “cap-switch” в ходе синтеза кДНК. Достигнув 5' конца мРНК-матрицы, олиго(dT)-праймированная ревертаза нематрично добавляет несколько добавочных дезоксицитидиновых нуклеотидов на 3' конец кДНК. При этом олигонуклеотид, содержащий олиго-рибо(G) последовательность на 3' конце, гибридизуется на дезоксицитидиновый трэк, что образует праймер, позволяющий ревертазе сменить матрицу и дополнительно досинтезировать на 3' конец первой цепи кДНК последовательность адаптора. Этот подход позволяет достаточно точно помечать 5' концы кДНК, соответствующие точкам старта транскрипции (Рис. 2.2.2). Затем на матрице первых цепей получают вторые цепи кДНК. Перед стадией гибридизации (3), кДНК обрабатывают рестриктазой AluI для предотвращения фоновой амплификации транскриптов, читаемых «насквозь» с вышележащих промоторов относительно направления транскрипции со стандартного промотора LTR (Рис. 2.2.2, стадия 1, шаг “обработка AluI”). Фермент AluI был выбран, поскольку в консенсусной последовательности HS LTR не содержится рестриктных сайтов для этой частощепящей Эндонуклеазы. Обработка кДНК ферментом AluI (Рис. 2.2.2) снижает выход фоновых продуктов на следующей стадии.

На второй стадии проводилась селективная ПЦР-амплификация геномных локусов, фланкирующих 3' концы HS LTR. Гибридизация кДНК с получаемым ампликоном используется для селекции именно тех молекул кДНК, которые содержат последовательность HS LTRs на 5' конце. Амплификация геномных фланков - это критически важный шаг, обеспечивающий специфичность всей процедуры в целом. Nested ПЦР позволяет проводить селективную амплификацию всех последовательностей, фланкирующих интересующие семейства геномных повторов, тогда как амплификация кДНК не могла бы предоставить такую же высокую селективность, поскольку точные позиции точек старта транскрипции в составе последовательности повтора могут варьировать для различных индивидуальных повторов (318, 331, 332) и, поэтому, дизайнирование подходящих праймеров для ПЦР было бы проблематично.

Для амплификации геномных участков, фланкирующих LTR, геномная ДНК человека была фрагментирована рестриктазой AluI, к полученным фрагментам был лигирован синтетический GC-богатый адапторный олигонуклеотид длиной 45 нуклеотидов (A1A2), а затем была проведена nested ПЦР амплификация с использованием HS LTR- и адаптор-специфических праймеров. Последовательность HS LTR не содержит рестриктных сайтов AluI, при этом эта рестриктаза образует сравнительно короткие фрагменты ДНК, на которые не действует эффект ПЦР-селекции по размеру фрагмента (68). Как было ранее показано, использование GC-богатых адапторов минимизирует фоновую амплификацию по механизму супрессии ПЦР (19, 80, 97), что приводит к практически 100%-селективной амплификации целевой фракции генома.

Ампликоны LTR-фланкирующих последовательностей обрабатывали экзонуклеазой ExoIII для создания 5' выступающих концов, которые требуются на стадии (3) для предотвращения фоновой кросс-гибридизации между LTR-содержащими последовательностями. Ранее мы показали, что ExoIII может быть использована для удаления адапторных последовательностей из состава молекул гибридизационной смеси (18, 19). При используемых условиях, ExoIII удаляет нуклеотиды со скоростью порядка ~5 нуклеотидов в минуту, что позволяет более-менее точно удалить ~30 3'-концевых нуклеотидов из состава ампликонов HS LTR. На последней стадии, рестрицированная кДНК гибридизуется с 3'-геномными фланками LTR. Для того, чтобы селективно амплифицировать гетеродуплексы, содержащие как геномные фланки LTR, так и 5' концевые фрагменты кДНК, образованных благодаря промоторной активности LTR, мы проводили ПЦР с праймером на 5'маркёрную последовательность в составе кДНК и праймер A2, специфичный для адаптора, лигированного к геномной ДНК. Для повышения специфичности, далее проводился дополнительный раунд ПЦР с праймерами A4 и LTRfor3 (Рис. 2.2.2).

В результате амплифицировались только целевые гетеродуплексы, но не дуплексы с кДНК, не связанной с экспрессией LTR, либо же содержащей насквозь прочитанные LTR. Фон, который потенциально может быть создан LTR, протранскрибированными насквозь в прямом направлении, пренебрежимо мал. Исследование баз данных транскрибируемых последовательностей человека выявило 38 транскриптов, содержащих «сквозные» (англ. read-through) HS LTR, среди них - только 4 LTR в прямой ориентации; рестрикция AluI “in silico” демонстрирует полное удаление всех подобных транскриптов из итоговых библиотек.

Полученные в ходе последней амплификации гетеродуплексы, названные Expressed LTR Tags (ELT), далее клонировали и секвенировали. Каждый ELT содержал 3'-концевой фрагмент HS LTR, участок 3' -фланкирующей геномной ДНК, а также адапторную последовательность (A4).

Детекция промоторной активности HS LTR при помощи GREM. Анализ последовательностей ELT позволял однозначно картировать соответствующие им одиночные и 3' провирусные LTR. Однако же, картирование невозможно в случае провирусных 5' LTR, поскольку транскрибируемые с них провирусные последовательности многократно повторены в геноме и обладают высокой степенью идентичности (Рис. 2.2.1). Результаты анализа библиотек ELT, полученные для паренхимы яичка и семиномы, а также созданная на их основе первая в мире карта промоторно активных геномных повторов семейства HS LTR, будут представлены в следующем разделе. Для пяти случайно отобранных одиночных LTR, обладающих промоторной активностью согласно данным GREM, нам удалось при помощи метода 5'RACE с точностью до нуклеотида картировать точку начала транскрипции (Рис. 2.2.3 (318). Во всех случаях, транскрипция инициировалась с одного и того же неканонического промотора, расположенного на границе участков R и U5 последовательности HS LTR.

Рисунок 2.2.3. Картирование точки начала транскрипции в составе последовательнсти LTR. A), картирование 5'-концевых частей кДНК, полученных в ходе ПЦР с праймером CS на 5' конец кДНК и с уникальными геномными праймерами G, на консенсусной последовательности семейства HS группы LTR HERV-K (HML-2). Последовательности потенциальных регуляторных участков даны курсивом. Б), схема ОТ-ПЦР-подхода к определению провирусной точки инициации транскрипции в составе LTR transcription. LTRfor3 и LTRfor4 -это LTR-специфичные праймеры на участки ниже и выше картированной точки начала транскрипции у одиночных LTR, соответственно. Gag - праймер, специфичный для вирусного гена gag. В), выравнивание фрагмента LTR длиной ~300 пн, который обладал промоторной активностью в экспериментах с экспрессией репортёрного гена (266), и консенсусной последовательности HS HERV-K LTR.

Транскрипционный уровень LTR линейно коррелирует с представленностью соответствующих ELT. Для исследования зависимости между представленностью ELT в библиотеках и транскрипционной активностью LTR, проводили ОТ-ПЦР с парами праймеров, один из которых, направленный наружу от LTR, был специфичным к 3' концевому участку LTR, а второй - к уникальному геномному локусу, лежащему на расстоянии от 70 до 300 пн от 3' конца LTR. Уровень транскрипции измеряли относительно гена бета-актина. Для выборки из 20 протестированных HS LTR, частоты встречаемости ELT в библиотеках линейно коррелировали с уровнем соответствующих им транскриптов, измеренным при помощи ОТ-ПЦР для обеих тканей, со значениями коэффициента корреляции 0.91 и 0.89 для паренхимы яичка и семиномы, соответственно (табл. 2.2.1). Это свидетельствует об адекватности метода GREM задаче одновременного качественного и количественного анализа промоторной активности исследуемой группы повторов.

Таблица 2.2.1. Соотношение уровней транскриптов LTR и частот встречаемости соответствующих ELT в библиотеках семиномы и паренхимы яичка.

a Относительный уровень транскрипции, измеренный методом ОТ-ПЦР.

2.3 Приложение GREM для поиска промоторно-активных эндогенных ретровирусов, специфичных для ДНК человека

Метод GREM использовали для создания библиотек ELT нормальной паренхимы яичка и соответствующей опухоли, семиномы. Биологические образцы брались от одного и того же пациента, так что распределение ELT между библиотеками отражает ткане- и опухоль-специфичность экспрессии чсЭРВ.

Для каждой ткани было отсеквенировано 500 клонов ELT. За вычетом плазмидных перестроек и плохо отсеквенированных последовательностей, осталось 395 и 419 ELT для паренхимы и семиномы, соответственно. Анализ ELT позволил нам однозначно картировать промоторно активные одиночные и 3'-провирусные LTR.

В общей сложности 78 представителей семейства HS (50%) оказались промоторно активными хотя бы в одной из тканей. Для многих индивидуальных LTR, содержание ELT значительно различалась в нормальной и опухолевой тканях. Многие LTR слабо транскрибировались и поэтому были представлены малым числом ELT. И наоборот, остальные НS элементы были представлены повышенным числом ELT (>10 ELTs). Например, для семи индивидуальных HS LTR и для фракции 5' провирусных LTR, частота встречаемости ELT, соответствующих этим элементам, различалась в пять раз между двумя сравниваемыми тканями.

Эти данные затем были подтверждены методом ОТ-ПЦР. Интересно, что фракция 5' провирусных LTR (с которых считываются вирусные гены), была в шесть раз более активна в семиноме, чем в паренхиме яичка, что хорошо сочетается с полученными ранее результатами по экспрессии чсЭРВ в линиях рака клеток зародышевого пути (98, 333, 334).

Качественный анализ: содержание промоторно-активных HS LTRs выше в ген-богатых областях. В ходе работы было установлено, что по крайней мере 50% всех представителей HS семейства являлись функциональными промоторами in vivo. Картирование членов семейства HS с помощью сервера UCSC human genome web browser позволило разделить их на четыре группы в зависимости от положения относительно известных генов человека (схема дана на Рис. 2.3.1 А): группа C1, расстояние от генов (D)>35 тпн, 80 HS элементов; (C2), 5D35 тпн, 24 элемента; (C3), HS элементы входят в состав интронов генов или D5 тпн, 40 представителей; (C4), HS элементы в составе экзонов мРНК, 12 представителей. Детальная информация относительно локализации соответствующих LTR, соседних генов и картированных мРНК в формате MS Excel размещена в Таблице 1 дополнительного материала по адресу в Интернет:

http://www.thescientificworld.com/supplements/2007.270/Buzdin_031307_SuppTable1.xls