Диссертация: Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

Поскольку число представителей для этих четырёх групп сильно различалось, для дальнейшей характеристики промоторной активности нами использовались не абсолютные величины, а относительные, нормированные на количество элементов в группе. На рис. 3.2.1 B приведены значения отношения суммарной промоторной активности LTR данной категории к количеству составляющих её элементов. Видно, что значение сравнительно мало для группы C1 (34%), тогда как для LTR, расположенных ближе к генам (группа C2) оно возрастает ~ в 1.8 раза (63%). Для LTR из интронов генов или расположенных в близком соседстве с ними (группа C3) значение ещё несколько выше (68%). Наконец, для LTR из экзонов генов (группа C4), было отмечено наивысшее значение промоторно активных элементов (75%).

Рисунок 2.3.1. Доля промоторно активных LTR в четырёх группах (C1-C4). (A) Относительное содержание промоторно активных LTR рассчитывали как отношение числа LTR каждой группы, для которых были обнаружены ELT, к общему числу LTR в группе. (B) Распредение промоторно активных LTR по группам. (C) LTR, обладающие промоторной активностью как в паренхиме яичка, так и в семиноме.

Также на Рис. 2.3.1 показано распределение по группам тех LTR, которые промоторно активны как в семиноме, так и в паренхиме яичка (в обеих тканях). На фоне невысоких долей для групп C1, C2 и C3 (10, 29, 20%), значительно выделяется группа С4 со значением 67%.

Можно сделать выводы, что (1) относительное содержание промоторно активных LTR в ген-богатых областях генома значительно выше, чем в локусах, обеднённых генами; (2) это содержание достигает максимальных значений для тех участков, где HS элементы “перекрываются” с клеточными транскрибируемыми последовательностями (группа C4); (3) LTR из группы C4, как правило, промоторно активны в обеих тканях. Очевидно более выраженная промоторная активность представителей группы C4 может объясняться, возможно, лучшей доступностью экзонных участков для транскрипционных факторов.

Количественный анализ: промоторная активность зависит от геномного окружения и от природы LTR (одиночный либо провирусный).

Анализ распределения ELT выявил различный уровень промоторной активности для одиночных и провирусных LTR, при этом различия зависели также и от геномного окружения. Экспрессия 5' провирусных LTR не может быть детально исследована по причинам, указанным в начале раздела, поэтому на количественном уровне анализировали распределение промоторно активных одиночных и 3' провирусных LTR среди групп C1-C4. Относительная промоторная сила для каждой группы HS элементов рассчитывалась как частное отношения числа всех ELT группы к суммарному числу ELT и относительного содержания HS элементов данной группы среди HS элементов всех групп (при всех рассчетах не учитывались 5' провирусные LTR).

Как показано на рисунке 2.3.2, 3' провирусные LTR обладают сходным транскрипционным профилем в обеих тканях: низкий уровень транскриптов для представителей группы C1, сильное (~30-60-кратное) повышение этого уровня в группе C2, потом опять довольно низкий уровень для группы C3 и, наконец, ~2.5-5-кратное повышение для группы C4. Профили для одиночных LTR выглядели по-другому: промоторная сила мала для группы C1, умеренна для групп C2 и C3 и, наконец, в 4_6 увеличена для группы C4. Хотелось бы отметить, что вновь максимальная промоторная активность одиночных LTR приходится на группу C4.

Рисунок 2.3.2. Относительная промоторная сила 3' провирусных (серый цвет) и одиночных LTR (чёрный), сгруппированных в зависимости от расстояния от генов (группы C1-C4). A, нормальная паренхима яичка; Б, семинома.

Полученные данные говорят о том, что в случае близости к генам транскрипция 3' провирусных LTR подавляется. Это может быть направлено на супрессию провирусных генов. Интересно, что относительная промоторная сила как одиночных, так и 3' провирусных LTR существенно понижена в группе С3 для нормальной ткани (паренхима яичка). Возможно, существует особый механизм селективной супрессии “лишних” промоторов, расположенных в интронах генов или очень близко от генов. Он мог бы минимизировать деструктивный эффект нежелательной фоновой транскрипции, включая экспрессию антисмысловых РНК, которые могут вмешиваться в устоявшиеся механизмы регуляции активности генов. В этой связи надо добавить, что ~90% интронных HS LTR находятся в обратной ориентации относительно направления генов; таким образом, транскрипция этих LTR может создавать пул регуляторных РНК (254).

Затем было проведено сравнение средних промоторных активностей для 5'провирусных, 3'провирусных и одиночных LTR (Рис. 2.3.3). Усреднённое значение относительной промоторной силы для каждой из групп рассчитывалось как частное относительного содержания соответствующих ELT в тотальном пуле ELT, и относительного содержания HS элементов этой группы относительно общего числа HS элементов.

Оказалось, что усреднённые значения промоторной силы для одиночных и 3' провирусных LTR практически совпадают, причём в обеих исследованных тканях. Промоторная сила 5' провирусных LTR была примерно вдвое выше в паренхиме яичка и в пять раз больше в семиноме, что отлично согласуется с большим количеством данных о предпочтительной экспрессии генов HERV-K (HML-2) именно в клетках раковых опухолей зародышевого пути. Можно предположить, что провирусные последовательности содержат некоторые пока не охарактеризованные регуляторные последовательности, лежащие ниже относительно LTR, которые и обеспечивают значительно более высокую экспрессию 5' провирусных LTR, особенно в семиноме.

Рисунок 2.3.3. Сравнение относительной промоторной силы одиночных, 5' провирусных и 3' провирусных LTR (на один LTR). Серые и чёрные столбцы представляют относительные промоторные силы LTR указанных типов в паренхиме яичка и в семиноме, соответственно.

Для того, чтобы исследовать, зависит ли промоторная активность LTR, картированных поблизости от генов, от уровня экспрессии этих генов, мы провели серию ОТ-ПЦР экспериментов, в которых была измерена транскрипция 16 генов, расположенных рядом со случайно выбранными представителями семейства HS. Ни в паренхиме, ни в семиноме, какой-либо выраженной корреляции между транскрипционными активностями генов и соседних LTR не наблюдалось.

Следует отметить, что частота встречаемости транскриптов варьировала ~ в 1000 раз (Рис. 2.3.4) среди различных индивидуальных представителей семейства HS: от крайне низкой и до уровня, сравнимого с генами домашнего хозяйства.

Высокий уровень промоторной активности некоторых LTR свидетельствует в пользу их возможной вовлечённости в регуляцию транскриптома хозяина.

Рисунок 2.3.4. Сравнение относительных уровней транскрипции некоторых генов человека и LTR. Относительные уровни транскрипции определяли при помощи ОТ-ПЦР, относительно уровня гена бета-актина (обозначен как 100%). A, паренхима яичка; Б, семинома.

Заключение. Впервые было проведено полногеномное сравнение in vivo-промоторной активности специфичных для генома человека эндогенных ретровирусов в нормальной и опухолевой тканях. Оказалось, что по крайней мере 50% HS элементов обладают промоторной активностью. Индивидуальные LTR экспрессировались на уровне от ~0.001 до ~3% относительно транскрипции гена бета-актина. Не наблюдалось связи между особенностями первичной структуры HS элементов и их транскрипционной активностью. И наоборот, функциональный статус LTR (одиночный, 5' или 3' провирусный) был одним из важнейших факторов: промоторные силы одиночных и 3' провирусных LTR были почти идентичны в обеих тканях, тогда как 5' провирусные LTR показали более сильную промоторную активность (вдвое и впятеро для паренхимы и семиномы, соответственно).

Это свидетельствует о наличии в провирусной последовательности некоторых пока не известных регуляторных элементов. Кроме того, важнейший фактор, влияющий на промоторную активность LTR - это расстояние от генов. Относительное содержание промоторно активных LTR в ген-богатых локусах значительно выше, чем в локусах, обеднённых генами.

Данные также свидетельствуют в пользу селективного подавления транскрипции 3' провирусных LTR, расположенных в интронах генов. Такая транскрипционная супрессия может быть нацелена на подавление активности провирусных генов, расположенных вблизи генов хозяина. Также в паренхиме яичка наблюдалось существенное понижение промоторной силы одиночных LTR в интронах генов. Это может свидетельствовать о существовании пока неустановленных механизмов подавления активности “лишних” промоторов, созданных мутациями или вирусными вставками, и расположенными вблизи генов или в интронах. Такой механизм может минимизировать деструктивный эффект «незапланированных» транскриптов - например, образование антисмысловых РНК. Многие транскрипционно компетентные LTR были картированы вблизи известных генов, и 86-90% этих генов транскрибируются в яичках. При этом не было выявлено никакой корреляции между уровнем транскрипции генов и соответствующих им LTR.

Таким образом, было проведено первое исчерпывающее качественное и количественное исследование промоторов человека, предоставленных небольшой группой эндогенных ретровирусов. Конечно, подавляющее большинство ретровирусных последовательностей, занимающих около 8% генома человека, ещё только предстоит исследовать. Но оптимизм внушает то, что разработанная методология вполне позволяет это сделать при наличии необходимых (достаточно скромных) временных и материальных ресурсов.

Детальные результаты картирования и анализа ELT, а также вся имеющаяся на сегодняшний день (31.12.2007) информация по структуре и функциональному статусу соответствующих HS LTR, содержатся в сводной таблице, доступной в Интернет по адресу: http://www.thescientificworld.com/supplements/2007.270/Buzdin_031307_SuppTable1.xls

2.4 Антисмысловая регуляция экспрессии генов молекулами РНК, транскрибируемыми с промоторов человек-специфичных эндогенных ретровирусов

Возможно, что помимо промоторной и энхансорной активности, HS LTR могут принимать участие в регуляции генов антисмысловыми транскриптами. Исследованию такой возможности посвящена данная часть диссертационной работы. Работа проводилась Е.В.Гогвадзе (молекулярно-генетическая и генноинженерные части) и Е.А.Стукачёвой (клеточная часть работы) под непосредственным руководством диссертанта и при поддержке Е.Д.Свердлова.

На первом этапе работы были проанализированы все человек-специфические ретроэлементы HERV-K (HML-2) и для дальнейшего анализа были отобраны все LTR (13 индивидуальных ретроэлементов), расположенные в интронах известных генов человека в противоположной направлению транскрипции данного гена ориентации и удаленные от ближайшего экзона не более, чем на 5 т.п.н. (рис 2.4.1)

Для каждого из исследуемых локусов были дизайнированы праймеры на экзоны, фланкирующие LTR (Gfor и Grev, рис 22), а также праймер на 3'- и 5' - концевую часть LTR. Праймеры Gfor+Grev применяли для определения уровня транскрипции гена, а Gfor+LTRfor и Gfor+LTRfor2 - для определения уровня транскрипции LTR, расположенного в интроне анализируемого гена. В качестве матрицы для ПЦР использовали первые цепи кДНК, синтезированные с помощью олиго(dT)-праймера на суммарной РНК нормальной паренхимы яичка человека и герминогенной опухоли - семиномы.

Методом ОТ-ПЦР с праймерами Gfor+Grev и Gfor+LTRfor был определен уровень транскрипции исследуемых генов, а также уровень транскрипции LTR, находящегося в интроне (таблица 2.4.1). В результате было отобрано 9 LTR, для которых было показано, что они транскрибируются в исследуемых тканях.

Таблица 2.4.1. Результаты ОТ-ПЦР анализа транскрипционной активности LTR и генов, в интроне которых они располагаются*.

*Цифры обозначают цикл ОТ-ПЦР, на котором появлялся соответствующий продукт; «-» - отсутствие детектируемого продукта; в качестве положительного контроля работы праймеров использовалась ДНК плаценты человека

Однако для того, чтобы понять, действительно ли транскрипция начинается внутри LTR, необходимо было найти 5'-конец образующейся РНК. Для этого был применен метод 5'- RACE (Rapid Amplification of cDNA ends). Схема метода и полученные результаты представлены на рисунке 2.4.2. В качестве матрицы использовались первые цепи кДНК нормальной паренхимы яичка и семиномы, синтезированные с использованием cap-switch эффекта.

Рис 23. Поиск точки начала транскрипции внутри изучаемых LTR.

(А) Схема метода 5'-RACE. В качестве матрицы используются первые цепи кДНК, синтезированные с использованием «cap-switch» эффекта. На первой стадии проводят ПЦР с супрессионным адаптером А1, внутренняя часть которого комплементарна олигонуклеотиду, использованному при синтезе кДНК, и праймером на известную последовательность гена (Gfor1) (в данном случае, на последовательность близлежащего к LTR экзона); положительный контроль проводят для проверки работы праймера на кДНК. Во втором раунде ПЦР используется супрессионный адаптер А2, внутренняя часть которого комплементарна внешней части праймера А1, и заглубленный праймер на экзон (Gfor2); отрицательный контроль проводится с использованием только праймера А2 для проверки качества работы супрессионных адаптеров.