В случае же метода targeted genomic differential display (TGDD), эффект ССП используется для амплификации набора фрагментов геномной ДНК или кДНК при помощи единственного таргетного праймера, комплементарного последовательности геномного повтора. Благодаря ССП, не происходит амплификации геномных фрагментов, не имеющих таргетный повтор. Ампликон содержит множество фрагментов, каждый из которых содержит часть повтора и один из фланкирующих геномных локусов. После разрешения продуктов ПЦР в ПААГ, наблюдается характеристический паттерн распределения фрагментов, специфичный для каждого образца геномной ДНК или кДНК (Рис. 2.4) (95-98). Выделение и секвенирование дифференциальных продуктов позволяло находить новые однонуклеотидные полиморфизмы, инсерции и делеции (96). В методе TGDD, сложность разрешаемого ампликона регулируется при помощи 3'-концевых якорных нуклеотидов, добавляемых к последовательности праймера, аналогично методу ODD и некоторым другим подходам (99) (83). Это позволяет разделить геномные фрагменты на неперекрывающиеся наборы адекватного размера для разделения в ПААГ.
Рисунок 2.4. Репрезентативная электрофореграмма результатов основанного на ССП дифференциального дисплея транскрипции эндогенных ретровирусов в нормальной (N1) и в двух образцах раковой ткани (O1 и O2). Фрагменты 1.1, 1.2 и 1.3 ярко представлены в образцах O1 и O2, но не видны в N1. Дифференциальные фрагменты вырезают из геля и секвенируют, затем их дифференциальный статус подтверждают независимыми методами, например, ОТ-ПЦР или Нозерн блот гибридизацией.
В отличие от других методов дифференциального дисплея, созданных для таргетинга геномных повторов (100, 101), TGDD показывает большую специфичность: ~90% всех клонов действительно содержали таргетные последовательности (96, 97). TGDD применяли для анализа геномного полиморфизма и тканеспецифичности экспрессии эндогенных ретровирусов человека (98), а также для поиска полиморфных инсерций других мобильных элементов человека - ретротранспозонов L1 (102).
Следует также упомянуть о недостатках этих подходов: (1) неравномерная амплификация различных последовательностей может приводить к перепредствленности одних и потере других отдельных индивидуальных фрагментов; (2) размер различных фрагментов, разрешаемых в ПААГ, может совпадать, что не позволяет идентифицировать ряд дифференциальных последовательностей.
2.5.2.2 Вычитающая гибридизация кДНК
Вычитающая гибридизация (ВГ) кДНК - это процесс гибридизации двух образцов кДНК, называемых трейсер и драйвер, целью которого является получение библиотеки, обогащенной целевыми последовательностями, специфичными для трейсера, но отсутствующими в драйвере. ВГ включает гибридизацию трейсера с избытком драйвера с последующей селекцией целевых последовательностей.
Использование ВГ кДНК позволило идентифицировать большое количество функционально важных генов, вовлечённых в эмбриональное развитие, клеточную дифференцировку, раковую трансформацию и метастазировние. Однако же, низкая представительность получающихся обогащённых библиотек, скромные значения обогащения по целевым последовательностям, а также трудоёмкость очистки обогащённой фракции ограничивают использование этого подхода, особенно в случаях, когда количества биологического материала малы, а содержание целевых транскриптов невелико (например, десятки копий на клетку).
Перечисленные минусы, практически полностью снимаются при использовании метода супрессионной вычитающей гибридизации (SSH) (10, 11), которая позволяет идентифицировать в том числе и редко представленные дифференциальные транскрипты благодаря стадии нормализации концентраций различных транскриптов в исследуемых образцах. Это становится возможным при использовании ССП (Рис. 2.2c). Эффективность этого протокола впервые была проверена в модельных экспериментах, где в качестве таргетных последовательностей выступала экзогенная вирусная ДНК, в определённых концентрациях добавленная к трейсеру (79). Метод затем использовали для поиска дифференциальных транскриптов во многих биологических системах, например, при активации иммунного ответа в культурах иммунокомпетентных клеток (85), при изменении потенциала метастазирования раковых клеток, при регенерации плоского червя планарии (91), а также для конструирования тканеспецифических библиотек кДНК человека (10). Наиболее важные преимущества SSH заключаются в следующем: (1) процедура включает две стадии гибридизации, что приводит также к эффективной нормализации концентраций различных кДНК, (2) требуется только один раунд гибридизации, (3) не требуется проводить физического разделения фракций одноцепочечной и двуцепочечной ДНК. Частота фальш-позитивных клонов мала и, как правило, составляет менее 10% (10). В результате, SSH стала одним из наиболее популярных и эффективных методов исследования дифференциальной транскрипции генов (103, 104). Следует также упомянуть, что индекс цитируемости оригинальной статьи, где впервые упомянут метод SSH в своём «проработанном» варианте (10), составляет на настоящий момент более 2000.
Техника SSH нашла широкое применение (105-108)). Отдельные элементы и стадии этого метода были позднее применены для решения некоторых других задач, например, для конструирования библиотек кДНК (84, 86) и поиска эволюционно консервативных последовательностей (77).
2.5.3 Поиск 5'- и 3'-концевых фрагментов кДНК
Одной из наиболее важных, но технически затруднительных задач, связанных с характеристикой генов, является приготовление полноразмерных кДНК. Обычные методы детекции генетических последовательностей (скрининг библиотек кДНК, клонирование консервативных генов при помощи ПЦР с вырожденными праймерами, идентификация дифференциально экспрессирующихся генов с использованием дифференциального дисплея мРНК, или же вычитающая гибридизация кДНК) обычно позволяют определить последовательность только лишь фрагмента целой кДНК. Для эффективного клонирования полноразмерных кДНК, был предложен комплекс методических подходов, называемый RACE (англ. Rapid amplification of cDNA ends), позволяющий проводить амплификацию концевых последовательностей кДНК in vitro (109)).
Большая часть методов RACE основана на введении в 3'-конец первой цепи кДНК искусственной последовательности, служащей в качестве эффективного сайта отжига для ПЦР праймеров. Однако же, проблема супрессии неспецифической амплификации в ходе RACE для последовательностей редких генов даже более серьёзна, чем при конструировании библиотек кДНК. ССП позволяет преодолеть эти сложности. К образцу кДНК лигируют супрессионные адапторы, а затем кДНК амплифицируют с праймером, соответствующим внешней части супрессионного адаптора и с ген-специфичным праймером. (Рис. 2.5, см. также обобщённую схему на Рис. 2.2a). Амплифицируются лишь те молекулы, которые содержат 5'- or 3'-концевые последовательности (в зависимости от используемых праймеров). Амплификация остальных молекул подавляется благодаря эффекту ССП. Эффективность метода была доказана как в модельных экспериментах, так и при решении множества практических задач (81).
Рисунок 2.5. Метод быстрой амплификации концов кДНК (RACE), основанный на эффекте ССП. Этот быстрый и недорогой подход позволяет клонировать и идентифицировать как 3'-, так и 5'-концевые фрагменты кДНК.
2.5.4 Поиск промоторных участков и модификация метода «прогулки по хромосоме»
Анализ геномной организации выделенных фрагментов кДНК и клонирование регуляторных элементов, особенно в случае отсутствия доступной полногеномной последовательности, крайне важны для структурно-функционального анализа генов. При этом большинство основанных на ПЦР методов прогулки по хромосоме трудоёмки и малоэффективны. Была предложена усовершенствованная техника, основанная на эффекте ССП (80). Для приготовления образца ДНК, содержащей ИКП, геномную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции и затем лигируют с супрессионным адаптором. При этом выявление регуляторных участков исследуемых генов проводится при последующей ПЦР с ген-специфичным и с адапторным праймерами, согласно уже упомянутой схеме выделения полноразмерной кДНК. Этот метод также нащёл широкое применение (110-115).
2.5.5 Клонирование In vitro
Хотя в последнее время большинство классических методов генной инженерии претерпело модернизацию или было заменено более эффективными подходами, основанными на ПЦР, традиционные методы сохранили основную роль при молекулярном клонировании ДНК (клонирование в бактериальные, фаговые и другие in vivo системы). Принципиально иной метод клонирования, базирующийся на ССП, названный клонированием in vitro, был предложен Лукьяновым и соавторами (84). Метод позволяет проводить ПЦР-амплификацию и последующее секвенирование индивидуальных молекул ДНК неизвестной структуры без стадии клонирования in vivo.
Метод включает в себя следующие стадии (Рис. 2.2b):
(1) Одновременное лигирование двух различных супрессионных адапторов к двуцепочечным фрагментам ДНК;
(2) Многократное разведение полученной смеси для доведения концентрации ДНК в объёме, который будет использован для дальнейшей амплификации, до порядка единиц молекул;
(3) ПЦР-амплификация единичных молекул ДНК при помощи праймеров, комплементарных внешним частям адапторов.
Получающиеся продукты ПЦР, так называемые in vitro клоны, соответствуют одиночным молекулам ДНК. Благодаря ССП, эти клоны оказываются фланкированы последовательностями различных адапторов, что позволяет проводить определение последовательности ДНК клонированных фрагментов согласно любому протоколу секвенирования продуктов ПЦР. Метод может быть использован для решения большого круга методических задач вместо традиционного клонирования in vivo. Метод особенно удобен, когда требуется не более, чем несколько десятков клонов (116). Также, был выработан протокол для быстрого приготовления панели перекрывающихся субклонированных фрагментов для секвенирования протяжённых фрагментов ДНК (~5тпн) (117).
2.5.6 Мультиплексная ПЦР
Супрессия ПЦР также использовалась для создания новой стратегии мультиплексной ПЦР (mПЦР). В ходе mПЦР, в одной и той же пробирке одновременно амплифицируются многие фрагменты ДНК (118). Амплификация каждой целевой ДНК при обычной ПЦР требует использования двух ген-специфичных праймеров. Когда одновременно амплифицируют много типов целевых фрагментов, часто невозможно бывает избежать нежелательных взаимодействий праймеров и добиться одинаково эффективного синтеза всех типов ДНК. Несмотря на множество работ, посвящённых выработке эффективных стратегий mПЦР (119, 120) и минимизации взаимодействий праймеров друг с другом (121), mПЦР по-прежнему нельзя назвать стандартной процедурой (122).
Хотя в некоторых случаях и удавалось добиваться высоких уровней мультиплексности в ходе ПЦР (123), это были, всё же, исключения из правила. Обычная mПЦР не позволяет проводить равномерную амплификацию более 5-10 целевых типов матриц. Использование ССП для мПЦР потребует всего лишь одного ген-специфичного праймера на каждый тип и одного праймера, общего для всех амплифицируемых молекул. Таким образом, n-плексная ПЦР потребует только n+1 праймеров вместо 2n , как при обычной ПЦР (Рис. 2.6). В согласии с теоретическими предпосылками, ССП- mПЦР позволила проводить более эффективную амплификацию многих таргетных последовательностей (122, 124), и лишь небольшой оптимизации условий реакции оказалось достаточно для одновременной амплификации 30 таргетных ДНК различной длины из разных хромосом человека (122).
Рисунок 2.6. Схема мультиплексной ПЦР амплификации с использованием только одного специфичного праймера на каждый амплифицируемый локус (вместо двух праймеров при обычной ПЦР).
Кроме того, ССП-mПЦР демонстрировала повышенную специфичность амплификации целевых последовательностей (122, 124). Хотя метод и включает в себя две дополнительных стадии по сравнению с классической мПЦР (расщепление геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирование адапторов), это не создаёт значительных трудностей. Было показано, что при амплификации многих таргетных фрагментов можно использовать одну эндонуклеазу рестрикции, так что один подготовленных образец ДНК может быть использован во многих экспериментах. Таким образом, приложение ССП для mПЦР предоставляет ряд преимуществ перед традиционными методами, таких как высокий уровень мультиплексности, более высокая специфичность, более простое дизайнирование праймеров и экономия затрат на их синтез (122).
Подводя итог, можно констатировать, что открытие эффекта ССП привело к созданию множества взаимнодополняющих прогрессивных методов анализа сложных образцов ДНК: конструирования библиотек кДНК, вычитающей гибридизации и дифференциального дисплея мРНК для поиска дифференциально экспрессирующихся генов, быстрого клонирования полноразмерной кДНК, прогулки по хромосоме для клонирования промоторов и других регуляторных участков, мультиплексной ПЦР, клонирования in vitro, и других приложений.
3. Использование сковородоподобных олигонуклеотидов как гибридизационных проб для нужд молекулярной биологии и биомедицины
Первоначально, сковородоподобные гибридизационные зонды представляли собой одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие участок, комплементарный целевой последовательности, фланкированный инвертированными повторами, образующими самокомплементарные концы, а также сопряжённую пару флуорофор / гаситель на 5'- и 3'-концах. Когда целевая последовательность отсутствует в гибридизационной смеси, такие зонды образуют сковородоподобные структуры, в которых флуорофор и гаситель флуоресценции оказываются пространственно сближенными. Это приводит к репрессии флуоресценции. Напротив, в присутствии целевой последовательности в гибридизационной смеси, зонд образует с ней комплекс, в котором гаситель и флуорофор пространственно разделены. Разделение флуорофора и гасителя приводит к повышению уровня флуоресценции, что позволяет проводить количественное измерение сигнала с пороговым значением, обозначающим присутствие целевой последовательности в образце. Кроме того, сковородообразные зонды могут использовать эффект FRET (fluorescence resonance energy transfer), при этом проводится мониторинг сдвига длины волны флуоресценции. Сковородоподобные зонды в настоящее время используются для многих задач, в основном для специфичной детекции мотивов нуклеиновых кислот и при ПЦР в реальном времени. Также сковородоподобные зонды применяют для исследования взаимодействия ДНК с белками, и даже для высокоспецифичной детекции неорганических ионов. Эта быстро эволюционирующая группа методов ежегодно находит отражение по крайней мере в 40 патентах и 50 статьях в реферируемых международных научных журналах.