3.3 Сковородоподобные ДНК-зонды для микрочиповой гибридизации
Не секрет, что точность детекции мутаций при помощи стандартной микрочиповой гибридизации с линейными зондами часто является неудовлетворительной (172), и требуются альтернативные подходы (рассмотрено в главе 6). Сковородоподобные ДНК-зонды, характеризующиеся повышенной точностью дискриминации неспаренных нуклеотидов, нашли своё применение для создания технологии ДНК-микрочипов с повышенной чувствительностью и точностью обнаружения однонуклеотидных замен. Имеющие форму шпильки зонды прикрепляют к поверхности твёрдого носителя (способ прикрепления - за последовательность петли или же за основание стебля шпильки - зависит от конкретной экспериментальной задачи) (124, 138, 173) (152, 174) (Рис. 5a). Зонды могут быть иммобилизованы, например, с помощью биотин-стрептавидиновой системы (138, 152, 174), или же ковалентно связаны с носителем при помощи различных химических агентов (124, 173, 175).
Иммобилизованные ДНК или ДНК-PNA (peptide nucleic acid) химерные беконы позволяют детектировать немеченые комплементарные последовательности в гибридизационной смеси (например, РНК, кДНК, или ПЦР ампликоны) (174, 176). SL ДНК зонды с обращённым в раствор основанием шпильки демонстрируют двукратное повышение скорости гибридизации и повышенную стабильность дуплекса зонд-целевая последовательность относительно линейных зондов (138). Также была предложена изящная методика, комбинирующая гибридизацию и энзиматическое лигирование SL ДНК зонда для детекции мутаций в одноцепочечных таргетных ДНК (Рис. 4.5) (124). Следует, однако, заметить, что технология микрочипов с использованием сковородоподобных ДНК зондов находится в стадии раннего развития.
Рисунок 3.5. Подход сопряжённых гибридизации и лигирования для детекции целевой последовательности с использованием нанесённых на микрочип молекулярных беконов.
3.4 Заключение
На настоящий момент, сковородоподобные ДНК зонды широко применяются для множества областей молекулярной биологии и биомедицины. Их преимуществами являются: (i) повышенная специфичность распознавания зонд-целевая последовательность и (ii) возможность проведения нескольких экспериментов в одной пробирке и мониторинга результатов в режиме реального времени.
Методы, сочетающие ДНК SL зонды с другими модулями (рибозимы и ДНКzymes, неорганические наночастицы, и др.) и новыми технологическими решениями (например, микрочипами, продвинутыми оптическими технологиями) в будущем, вероятно, будут широко применимы для исследовательских целей и для молекулярной диагностики. Наконец, стратегия молекулярных беконов, особенно в комбинации с технологией аптамеров, предоставляет новые возможности для исследования ДНК-белковых взаимодействий. Например, меченный с помощью FRET молекулярный бекон - аптамер может связываться со специфическим белковым биомаркером, platelet-derived growth factor (PDGF) (177). Такой сенсор может детектировать целевой белок начиная с концентрации 10 нг PDGF на микрограмм белка культуральной среды (177).
В целом, успех этой быстро эволюционирующей группы методов ежегодно находит отражение по крайней мере в 40 патентах и 50 статьях в реферируемых международных научных журналах.
4. Нормализация библиотек кДНК
Количество копий различных индивидуальных мРНК в транскриптоме клетки может различаться на несколько порядков. Это соотношение разных типов транскриптов сохраняется и в кДНК. Методы нормализации позволяют выравнивать представленность транскриптов в библиотеках. Нормализованные библиотеки кДНК используются для функционального скрининга кДНК и для поиска новых генов, транскрибируемых на относительно низком уровне. В этой главе рассмотрены методы нормализации, основанные на гибридизации ДНК или РНК.
4.1 Введение
4.1.1 Для чего нужна нормализация библиотек кДНК
Исследование пулов мРНК позволяет лучше понимать генетическую регуляцию многих биологических процессов. Современные методы позволяют находить дифференциальные мРНК, исследовать их пространственно-временную регуляцию в организме и, наконец, приближаться к пониманию функций закодированных в них белков. Масштабный анализ клеточной мРНК (транскриптома) стал чрезвычайно популярным в последнее десятилетие (Guigo et al. 2000).
В эукариотической клетке, мРНК составляет 1-5% от общей массы РНК, при этом количество экспрессирующихся генов варьирует от десятков до десятков тысяч. Кроме того, количество копий мРНК на тот или иной экспрессирующийся ген может различаться на несколько порядков. Как правило, 5-10 основных «генов домашнего хозяйства» дают ~20% от общей массы РНК, 500-2000 генов, транскрибируемых на промежуточном уровне, составляют 40-60% массы транскриптома, а 10000-20000 слабо транскрибируемых генов - 20-40% мРНК mass (Alberts et al. 1994).
Методы исследования мРНК, как правило, связаны с манипуляциями не с мРНК, а с комплементарной ДНК (кДНК). На настоящее время разработаны методы, позволяющие создавать репрезентативные библиотеки кДНК из крайне малых количеств тотальной РНК (0.1-1 мг).
К библиотекам кДНК, как правило, предъявляются следующие требования: они должны быть репрезентативными, то есть содержать копии всех или практически всех транскриптов, имеющихся в образце. В случае библиотек, полученных при помощи ПЦР, это требование ограничивает количество циклов. Обычно, для этих целей используют не более 25 циклов ПЦР; в противном случае, библиотеки получаются нерепрезентативными (Matz 2002).
Во-вторых, для многих целей требуется кДНК, обогащённая полноразмерными последовательностями. Например, секвенирование полноразмерной кДНК позволяет предсказывать полную аминокислотную последовательность соответствующего белка. Более того, функциональный скрининг библиотек целесообразно проводить именно для полноразмерных кДНК.
Наконец, часто бывает важно минимизировать искажение соотношения различных типов транскриптов в кДНК, так, чтобы оно как можно точнее соответствовало бы соотношению в исходной мРНК. И наоборот, для некоторых задач концентрации индивидуальных типов кДНК должны быть выравнены.
Методы, позволяющие уменьшить преобладание «мажорных» транскриптов и увеличить содержание «минорных» в библиотеках кДНК, называются методами нормализации кДНК. Библиотеки, в которых различия в концентрации мажорных и минорных генов меньше, чем таковые для исходных образцов мРНК или кДНК, называются нормализованными. В идеальном случае, в такой библиотеке концентрации всех транскриптов равны.
Нормализованные библиотеки кДНК, как правило, используются для поиска новых генов, транскрибируемых на низком уровне. Исходная частота встречаемости кДНК слабо транскрибируемого гена может быть менее 2Ч10-6, тогда как в идеально нормализованной библиотеке она будет выше ~ в 25 раз (Soares et al. 1994). Поэтому, так называемое «полное» секвенирование нормализованных библиотек (с 5-кратным клональным перекрытием) подразумевает секвенирование на порядок меньшего числа клонов по сравнению с обычной библиотекой кДНК. Уменьшается также и количество анализируемых клонов при функциональном скрининге библиотек кДНК.
4.1.2 Оценка эффективности нормализации
Для контроля за эффективностью нормализации, целесообразно проводить сравнение концентраций мажорных и минорных транскриптов в библиотеках до и после стадии нормализации. Для этого можно использовать количественную ПЦР в реальном времени или гибридизацию по Саузерну. Чем более эффективно прошла нормализация, тем меньше разница между содержанием транскриптов различных типов.
В качестве альтернативы можно проводить масштабное секвенирование клонированных библиотек кДНК с последующим анализом содержания присутствующих в них транскриптов. Каждый индивидуальный транскрипт будет представлен n копиями, где n - это положительное целое число. Полезно бывает графически отобразить соотношение между числом индивидуальных транскриптов (генов) и значениями n. Чем ближе получившаяся гистограмма к нормальному распределению по Пуассону, тем более эффективной следует признать нормализацию.
4.2 Основные подходы к нормализации библиотек кДНК
В настоящее время, разработано два основных подхода к нормализации кДНК.
Первый подход основан на физическом выделении всех транскриптов в равных количествах из исходных библиотек кДНК. Теоретически, для этого можно использовать соответствующую денатурированную геномную ДНК, иммобилизованную на твёрдом носителе (Weissman 1987). Насыщающая гибридизация такого набора, дополненная последующим выделением связанной кДНК, приводит к созданию нормализованной библиотеки. Поскольку практически все гены представлены в геноме одной или несколькими копиями, то и количество загибридизовавшейся кДНК будет более-менее одинаковым для всех транскриптов. Впрочем, в такой системе невозможно исследовать минорные транскрипты, поскольку для них невозможно достичь концентраций, при которых гибридизация с иммобилизованной геномной ДНК действительно была бы насыщающей.
Второй подход основывается на последовательных денатурации-гибридизации двуцепочечных молекул кДНК или гетеродуплексов мРНК/ первая цепь кДНК. Для каждого отдельного транскрипта, скорость гибридизации будет пропорциональна квадрату его концентрации. Таким образом, чем выше исходная концентрация индивидуального типа кДНК, тем больше молекул реассоциируют (образуют дуплекс) за определённый отрезок времени. Тогда после стадии денатурации-реассоциации, библиотека кДНК будет состоять из двух типов молекул: (1) фракция двуцепочечной кДНК, и (2) фракция одноцепочечной кДНК, содержащая различные индивидуальные типы кДНК в существенно выровненных концентрациях (Young and Andersen 1985; Galau et al. 1977).
Для этой группы методов, критической стадией является последующее разделение вышеупомянутых фракций. Эффективное решение этой технически нетривиальной задачи было предложено лишь в последние годы (Zhulidov et al. 2004).
Для разделения фракций одно- и двуцепочечной кДНК, можно применять следующие подходы: физическое разделение (а), селективная амплификация (б), а также энзиматическая деградация пула двуцепочечной кДНК (в).
(а) Физическое разделения осуществляют с помощью колоночной хроматографии на гидроксиапатитовом сорбенте (Ko 1990; Soares et al. 1994), при иммобилизации первых цепей кДНК на гранулах твёрдофазного носителя (Sasaki et al. 1994; Tanaka et al. 1996), или же с помощью биотинилирования исходной РНК (Carninci et al. 2000). Эти методы обладают тремя общими недостатками: они трудоёмки, требуют больших количеств исходного материала и слабо воспроизводимы.
(б) Селективная амплификация нормализованной кДНК основана на эффекте супрессии ПЦР ((Lukyanov et al. 1996); см. Главу 2). Такой подход применим лишь для библиотек фрагментированных кДНК и нерационален при функциональном скрининге библиотек.
Способ энзиматической деградации двуцепочечной фракции (в), по-видимому, является наиболее прогрессивным. Фермент (или смесь соответствующих ферментов) гидролизует двуцепочечную фракцию кДНК, оставляя одноцепочечную кДНК интактной. Фермент должен быть активен при высокой температуре (60-70°C), что позволит при его использовании минимизировать фоновый гидролиз кДНК, связанный с образованием участков вторичной структуры в составе одноцепочечных молекул. Гидролиз при помощи смеси частощепящих (узнающих 4-нуклеотидный мотив в составе дуплкса ДНК) рестриктаз оказался низко эффективным (Coche and Dewez 1994). Недавно для этих целей был применён новый фермент - дуплекс-специфичная нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба (DSN) (Shagin et al. 2002). На настоящий момент, DSN-нормализация представляется предпочтительным подходом при создании нормализованных библиотек кДНК (Zhulidov et al. 2004). Этот метод рассматривается подробнее в следующем разделе главы.
4.2.1 Создание нормализованных библиотек, обогащённых полноразмерными кДНК, с использованием дуплекс-специфичной нуклеазы (ДСН-нормализиция)
Этот подход схематически изображён на рисунке 4.1. Метод включает в себя денатурацию и последующую реассоциацию двуцепочечной кДНК, фланкированной адапторными последовательностями. После этого гибридизационную смесь обрабатывают дуплекс-специфичной нуклеазой из гепатопанкреаса камчатского краба (DSN) для избирательной деградации двуцепочечных молекул, образовавшихся при гибридизации. Одноцепочечная фракция, содержащая транскрипты в относительно выровненных концентрациях, остаётся в растворе и подлежит дальнейшей ПЦР амплификации (Zhulidov et al. 2004; Zhulidov et al. 2005).
В ходе выравнивания используются стандартные условия реассоциации, разработанные для метода супрессионной вычитающей гибридизации ((Diatchenko et al. 1996); Глава 2). Рекомендовано использование формамидного буфера согласно Carninci и др. (Carninci et al. 2000), что позволяет предотвратить образование вторичных структур в составе одноцепочечной фракции кДНК.
Метод основан на избирательной деградации двуцепочечной фракции под действием DSN. DSN характеризуется сильным предпочтением к расщеплению дуплексов ДНК-ДНК и ДНК-РНК по сравнению с одноцепочечными ДНК и РНК, независимо от длины дуплекса. Фермент стабилен при широком диапазоне температур и демонстрирует оптимальные показатели активности при 55-65OC (Shagin et al. 2002), что позволяет использовать его при высоких температурах, препятствующих образованию нежелательных вторичных структур в составе одноцепочечной фракции.
Заключительная стадия DSN-нормализации - это ПЦР амплификация нормализованной одноцепочечной фракции. Для того, чтобы преодолеть хорошо известный эффект ПЦР селекции, благодаря которому предпочтительно амплифицируются более короткие фрагменты ДНК, используются два основных подхода. Во-первых, используются энзиматические системы для ПЦР амплификации длинных фрагментов, одинаково хорошо амплифицирующие длинные и короткие фрагменты (Barnes 1994), а во-вторых, средняя длина продуктов ПЦР частично регулируется эффектом супрессии ПЦР ((Shagin et al. 1999); Глава 2)
Адапторные последовательности вводятся на концы кДНК как описано ранее в Главе 2 (Zhu et al. 2001).
Рисунок 4.1. Схема DSN-нормализации. Чёрные линии показывают мажорные транскрипты, серые - минорные. Прямоугольниками обозначены адапторные последовательности.
5. Клонирование совпадений: эффективный метод экспериментального выделения общих последовательностей