3.1 Введение
Природные сковородоподобные структуры в составе РНК и ДНК исполняют важные регуляторные роли при нормальном функционировании клетки (125-127). Помимо узнавания белками (128) и специфического сайленсинга генов (129), сковородоподобные структуры показывают ряд преимуществ при гибридизации нуклеиновых кислот, по сравнению с другими конформациями (122, 130-134)). Использование олигонуклеотидов, формирующих на концах сковородоподобные структуры, для эффекта супрессии ПЦР, что позволило создать множество полезных экспериментальных подходов, основанных на ПЦР, рассмотрено во второй главе данного обзора и не будет упомянуто в этой части. Настоящая глава посвящена применению сковородоподобных (англ. stem loop - SL) олигонуклеотидов как зондов для гибридизации. Преимущества сковородоподобных олигонуклеотидов были чётко продемонстрированы при сравнении гибридизации линейных и сковородоподобных (называемых также molecular beacon-“молекулярные беконы”) ДНК-зондов. Последние показали значительно большую специфичность гибридизации (135, 136). С помощью анализа фазовых диаграмм свободной энергии молекулярных беконов в гибридизационной смеси в присутствии и без специфической целевой последовательности, авторы показали, что структурированные зонды могут специфично дискриминировать неспаренные нуклеотиды в большем диапазоне температур, чем при использовании неструктурированных зондов (122, 136).
Возможным объяснением этого эффекта может быть более низкая свободная энергия отжига SL зонда, связанная с меньшим количеством возможных конфигураций (и, соответственно, с пониженной энтропией гибридизации) (137). Выступающие петлевые участки, комплементарные целевой последовательности, лучше экспонированы для гибридизации по сравнению с линейным зондом. Основное преимущество структурированных зондов заключается в улучшенной дискриминации неспаренных олигонуклеотидов (138). SL структуры могут использоваться для гибридизации в растворе (например, в качестве специфического зонда при количественной ПЦР в реальном времени (139)), или же могут быть закреплены на твёрдом носителе таким образом, что петлевые участки иммобилизованы на его поверхности, а самокомплементарные концевые участки участвуют в распознавании целевой последовательности в гибридизационной смеси (122, 138).
3.2 «Молекулярные беконы»
Первоначально, сковородоподобные гибридизационные зонды представляли собой одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие участок, комплементарный целевой последовательности, фланкированный инвертированными повторами, образующими самокомплементарные концы, а также сопряжённую пару флуорофор / гаситель на 5'- и 3'-концах (140, 141) (Рис. 4.1). Когда целевая последовательность отсутствует в гибридизационной смеси, такие зонды образуют сковородоподобные структуры, в которых флуорофор и гаситель флуоресценции оказываются пространственно сближенными. Это приводит к репрессии флуоресценции. Напротив, в присутствии целевой последовательности в гибридизационной смеси, зонд образует с ней комплекс, в котором гаситель (например, часто используемое для этих целей вещество 4-{[4'-(диметиламино)фенил]азо}бензойная кислота (DABCYL)) и флуорофор пространственно разделены. Разделение флуорофора и гасителя приводит к повышению уровня флуоресценции, что позволяет проводить количественное измерение сигнала с пороговым значением, обозначающим присутствие целевой последовательности в образце (Рис. 3.1) (122).
Рисунок 3.1. Принцип действия молекулярных беконов первого поколения. Зонд образует сковородоподобную структуру благодаря внутримолекулярному спариванию инвертированных повторов на его концах. Зонд помечен флуорофором и гасителем флуоресценции на своих противоположных концах. При добавлении комплементарной зонду целевой последовательности, более сильное спаривание между целевой последовательностью и молекулярном беконом разрушает исходную сковородоподобную структуру и фруорофор пространственно удаляется от гасителя, что позволяет детектировать флуоресценцию.
Кроме того, сковородообразные зонды могут использовать эффект FRET (англ. fluorescence resonance energy transfer), при этом проводится мониторинг сдвига длины волны флуоресценции (Рис. 4.2). Энергия возбуждения флуоресценции может переноситься с одного флуорофора на другой при резонансном переносе энергии. После поглощения фотона и перехода в возбуждённое состояние, донорный флуорофор D может перенести энергию возбуждённого состояния на второй хромофор (акцептор, или A) непосредственно, без испускания фотона. Эффективность такого переноса энергии зависит, помимо прочего, от протяжённости участка перекрывания зон в спектрах испускания для D и поглощения для A, от относительной ориентации обоих флуорофоров, и - от расстояния между D и A.
FRET можно использовать для измерения расстояний от 20 до 100 Е (142), для детекции конформационных изменений и измерения их количественных характеристик (143). Наиболее часто FRET используется для исследования белковых взаимодействий и для создания гибридизационных ДНК-зондов (144-147). В случае молекулярных беконов, донорные и акцепторные флуорофоры прикрепляют к двум различным сторонам участка основания шпильки сковородоподобной структуры. Если оба флуорофора колокализуются, может осуществляться резонансный перенос энергии, и будет наблюдаться характеристический пик флуоресценции (типичный для акцептора); и наоборот, когда сковородоподобная конформация зонда нарушена, донорный и акцепторный флуорофоры находятся на слишком большом расстоянии друг от друга, и эффективный перенос энергии между ними невозможен.
Рисунок 3.2. Пример методики, использующей молекулярные беконы, помеченные при помощи FRET.
Подход молекулярных беконов быстро завоевал популярность для некоторых применений в силу его относительной простоты и возможности отслеживания протекающих процессов в реальном времени (134).
Благодаря улучшенному дискриминированию неспаренных нуклеотидов, ДНК молекулярные беконы успешно применяют для детекции однонуклеотидных полиморфизмов (141, 148, 149), для количественной ПЦР в реальном времени (150, 151), в качестве иммобилизованных зондов для ДНК-микрочипов (152-154), и как комплементарные зонды для детекции целевых РНК in vivo (122, 155). За последние годы был разработан ряд усовершенствований этой технологии. Например, несколько целевых типов молекул нуклеиновых кислот могут детектироваться одновременно в одном опыте с использованием различно окрашенных молекулярных беконов (150, 151). Была сильно увеличена чувствительность метода, который используется, например, для детекции патогенных вирусных и бактериальных штаммов (156-158).
В другом случае, точность и чувствительность метода были существенно повышены при использовании золотых наночастиц в качестве гасителя. Преимущество достигается благодаря более выраженной способности к гашению флуоресценции у кластеров золотых частиц (159). В случае, когда флуоресцентно меченные олигонуклеотиды оказываются поблизости от металлических поверхностей, интенсивность испускания зависит как от электромагнитных эффектов (то есть, гашение флуоресценции или усиление испускания), так и от структуры нуклеиновых кислот (например, неупорядоченной, петлевой, шпилечной, или дуплексной) (160). Использование металлических наночастиц для стратегии молекулярных беконов открывает новые перспективы для создания гасителей флуоресценции нового поколения с сильно различающимися характеристиками. Такие различия в свойствах могут быть заданы формой, размером и составом металлического кластера. В будущем, одновременная детекция нескольких целевых последовательностей в одной пробирке может быть осуществлена при использовании нескольких металлических гасителей флуоресценции (159). Альтернатива этому решению проблемы мультиплексной идентификации целевой последовательности в растворе - использование молекулярных беконов, сдвигающих длину волны испускания флуорофора (161). Впрочем, некоторые высокочувствительные методы детекции, основанные на молекулярных беконах, меченных различными флуорофорами, уже вошли в повседневную практику (162-164).
Уайткомб и соавторы объединили молекулярный бекон и праймер для ПЦР в едином SL зонде, названном “скорпион” (165). В этом подходе, ПЦР содержит 5'-выступающий участок, имеющий все характеристики бекона: петлевой участок, комплементарный целевой последовательности, фланкированный самокомплементарным стеблем, и пару флуорофор / гаситель на 5'- и 3'-концах этого участка, соответственно (Рис. 4.3) (122). Сковородоподобный участок соединён с ПЦР праймером через химически модифицированную линкерную последовательность, которая предотвращает амплификацию сковородоподобной структуры ДНК полимеразой. В ходе ПЦР, когда праймер достраивается и синтезируется целевая последовательность ДНК, сковородоподобная структура разворачивается и петлевой участок внутримолекулярно гибридизуется с целевой последовательностью, что повышает флуоресценцию (Рис. 4.3). Таким образом, скорпион-праймер использует мономолекулярный механизм гибридизации зонд-целевая последовательность, а не бимолекулярное узнавание, как при традиционном использовании молекулярных беконов. Это обуславливает более быструю кинетику гибридизации и увеличивает стабильность комплекса зонд-целевая последовательность (122, 166).
Рисунок 3.3. Молекулярный бекон типа “скорпион”. Зонд скорпион имеет модули молекулярного бекона и праймера для ПЦР. Когда целевая последовательность амплифицируется при помощи модуля праймера, бекон разворачивается и пара флуорофор\гаситель пространственно разделяется, что повышает флуоресценцию.
Следующая многообещающая техника основана на применении каталитических ДНК (ДНКzymes) в комбинации с молекулярными беконами. В этом случае, ПЦР праймер содержит последовательность, комплементарную каталитической ДНК (167). В ходе ПЦР, образуется активный ампликон, который расщепляет вносимый в реакционную смесь флуоресцентный субстрат в форме молекулярного бекона, что повышает флуоресценцию. Подход универсален, поскольку для детекции совершенно различных геномных целевых последовательностей используется одна универсальная пара ДНКzyme - субстрат (122).
Каталитические молекулярные беконы представляют собой следующее поколение молекулярных зондов с возможностью амплификации сигнала и детекции целевых нуклеотидных последовательностей без ПЦР амплификации. В данном случае, создаётся сложный двуцепочечный ДНК-зонд, сочетающий в себе свойства молекулярного бекона и ДНКzyme типа hammerhead; эти два модуля локализуются на различных цепях, на двух противоположных концах ДНК (168) (Рис. 4.4). В отсутствии целевой последовательности, модуль ДНКzyme блокирован гибридизацией с модулем бекона. При добавлении целевой последовательности, модуль бекона меняет свою конформацию и позволяет модулю ДНКzyme гидролизовать субстрат, который представляет собой линейный олигонуклеотид с флуорофором и гасителем на противоположных концах. ДНКzyme расщепляет субстрат по позиции специально вводимого в него рибонуклеотида, что разбивает связь флуорофора и гасителя и приводит к усилению флуоресценции. Расщеплённый субстрат диссоциирует, ДНКzyme вновь гибридизуется с модулем бекона, и цикл повторяется. Хотя флуоресцентный ответ, вызываемый круговоротом субстрата, был в несколько раз ниже, чем ответ, вызываемый изменением конформации обычного молекулярного бекона (168), этот подход был безусловно интересен, поскольку включал стадию каталитического расщепления (122). В отличие от классического протокола молекулярного бекона, основывающегося лишь на связывание с целевой последовательностью, этот метод использует каталитическое расщепление для высвобождения флуорофора для детекции и количественного анализа, что делает возможным использовать каталитический цикл для амплификации сигнала.
Рисунок 3.4. Молекулярный бекон, функционирующий как ДНКzyme. Без целевой последовательности, модуль ДНКzyme блокирован гибридизацией с модулем бекона. При добавлении целевой последовательности, модуль бекон меняет конформацию и позволяет модулю ДНКzyme гидролизовать субстрат, представляющий собой линейный олигонуклеотид с флуорофором и гасителем на противоположных концах. ДНКzyme расщепляет субстрат по последовательности специально введенного рибонуклеотида, что пространственно разобщает флуорофор и гаситель и повышает флуоресценцию.
В отличие от классических молекулярных беконов, которые детектируют лишь нуклеиновые кислоты, каталитические молекулярные беконы могут применяться для детекции более широкого спектра анализируемых веществ.
В частности, методы, нацеленные на детекцию ионов металлов (например, ионов двухвалентного свинца (169)) основаны на наблюдении, что практически все ДНКzymes, обладающие нуклеазной активностью при положении субстрата in trans, обладают сходной структурой, состоящей из каталитического кора ДНКzyme, фланкированного двумя субстрат-узнающими плечами. На основе типичного ДНКzyme, названного "8-17", удалось создать высокочувствительный и точный сенсор ионов Pb2+. Пара флуорофор-гаситель располагается пространственно близко, при этом флуорофор находится на 5'-конце субстрата, а гаситель - на 3'-конце фермента, и дополнительная молекула гасителя навешена на 3'-конец субстрата (дополнительная копия гасителя требуется для супрессии фоновой флуоресценции) (170). При этом фермент становится каталитически активен лишь в присутствии ионов свинца. Метод двойного гасителя позволяет получить сенсор, работающий при более широком спектре температур с высоким отношением сигнала к фону.
Если удастся создать структуру каталитического бекона, которая будет оптимизирована для быстрого оборота молекул субстрата, эта группа методов станет хорошей альтернативой методам детекции целевых последовательностей, основанным на ПЦР амплификации, или даже методам определения неорганических ионов. Однако же, на настоящий момент этот подход всё ещё находится на стадии развития и пока что далёк от рутинного применения.
Интересно, что молекулярные беконы могут быть доставлены непосредственно внутрь живой клетки либо при помощи обычных реагентов, применяемых для трансфекции, либо (более эффективно) при введении холестерольной группы на конец стебля шпильки бекона. Такой зонд, проникающий сквозь клеточную мембрану, может быть использован как превосходный биосенсор для мониторинга in-vivo в режиме реального времени экспрессии генов на уровне РНК и последующей судьбы клеточных транскриптов (130, 171).