Материал: Застосування Грицика у медицині

Вивчення хімічного складу ліпофільній фракції

Методи виділення флавоноїдів

Метод виділення залежить від характеру рослинного матеріалу і типу флавоноїду, який необхідно виділити. Вибір розчинника для екстракції залежить від полярності флавоноїду. Більш полярні розчинники використовують для екстракції глікозидів і антоціанів, а менш полярні для агликонов. Ізофлавони, флавони, дігідрофлавони, сильно метиловані флавони і флавоноли екстрагують бензолом, хлороформом, ефіром, етилацетатом. Глікозиди, сильно гідроксильовані флавоноїди, аурони, халкони, легко переходять в спирти різної концентрації або ацетон [24].

Після екстракції, спиртове витяг упарюють, до залишку додають гарячу воду, охолоджують, видаляють неполярні сполуки (жирне масло, ефірне масло) з водної фази хлороформом або чотирихлористого вуглецю. Потім флавоноїди з водної фази витягують послідовно етиловим спиртом (аглікони), етилацетатом (монозіди) і бутанолом (біозідом, тріозіди). Для розділення компонентів кожної фракції використовують колоночную хроматографію на силікагелі, поліамідних сорбентів або целюлозі.

Методи ідентифікації флавоноїдів

Для ідентифікації флавоноїдів використовують їх фізико-хімічні властивості; температуру плавлення, питоме обертання (глікозидів), УФ-, ІЧ-, ПМР - спектри, порівнюючи їх зі спектрами відомих зразків [1; 3; 23].

УФ спектр флавоноїдів характеризується наявністю, як правило, двох максимумів поглинання. Поглинання максимумів і їх інтенсивність характерні для різних груп флавоноїдів [30].

Реакції, специфічні для всіх груп флавоноїдів, відсутні. Найбільш часто використовуються наступні реакції:

1. Ціанідіновая реакція або проба ChinodaФлавоноїди, флавонони і флавони при відновленні магнієм у присутності хлористоводневої кислоти дають червоне або оранжеве забарвлення, обумовлене утворенням антоцианидинов [40]:

Ціанідин хлорид

2. Борно-лимонна реакція. 5 - оксіфлавони і 5 - оксіфлавоноли взаємодіють з борною кислотою в присутності лимонної, утворюючи яскраво-жовте забарвлення з жовто-зеленою флуоресценцією (освіта Батохромний комплексу) [9]:

3. Реакція з треххлористой сурмою. 5 - оксіфлавони і 5 - флавоноли, взаємодіючи з треххлористой сурмою, утворюють комплексні сполуки, пофарбовані в жовтий або червоний колір [49]:

• 4. З розчином аміаку. Флавоноли, флаванони і флавони дають жовте забарвлення з розчином аміаку, при нагріванні переходить у помаранчеве або червоне: халкони і аурони дають червоне або пурпурне забарвлення без нагрівання. Антоціани в присутності аміаку або карбонату натрію дають синє або фіолетове забарвлення.
• 5. Флавони, халкони, аурони, що містять вільні ортогідроксільние угруповання в кільці-В, при обробці спиртових розчинів середнім оцтовокислим свинцем утворюють опади, пофарбовані в яскраво - жовтий і червоний кольори.
• 6. З метою виявлення флавоноїдів в рослинному матеріалі широко використовується хроматографія на папері і в тонкому шарі сорбенту. Виявлення компонентів на хроматограмі здійснюється просматриванием їх в УФ - світлі. При цьому флавонони, флавонол-3-глікозиди, флаванони, халкони виявляються у вигляді коричневих плям; флавоноли і їх 7-глікозиди - у вигляді жовтих плям [29].

Кількісне та якісне визначення біологічно активних речовин ліпофільній фракції

Попереднє дослідження на основні групи біологічно активних речовин показало, що в траві грициків, що виростає в Харківській області, містяться: флавоноїди, кумарини, дубильні речовини, сапоніни, полісахариди, алкалоїди, вітамін K₁,

Кількісне визначення флавоноїдів

Дослідження проводили на цільних і подрібнених зразках трави грициків від промислових партій та індивідуального збору 2010-2014 років; рідкому екстракті і субстанції "сухий екстракт", отриманих в лабораторних умовах, а також, зразках рідкого екстракту промислового виробництва. Сировина збирали і сушили згідно інструкції по заготівлі та у відповідності з поставленими завданнями.

Кількісну оцінку суми екстрактивних речовин проводили гравіметричним методом за ГОСТ 24027.2-80, а також, методиці ГФХ1, в.1.
Проводили спектральні дослідження етанольних витягів з трави грициків різної концентрації та спектрів адсорбції з 2% -ним спиртовим розчином алюмінію хлориду [29].

Кількісний вміст флавоноїдів у сировині та препаратах визначали з використанням диференціального варіанту спектрофотометрического методу, запропонованого В. В. Беліковим зі співавторами і модифікованому нами для сировини і препаратів Грицика звичайного [8].

Оцінку екологічної чистоти сировини проводили за вмістом важких металів за методикою ГФ XI, в.1 і полярографическим методом.

Якісне визначення флавоноїдів

Для якісного аналізу трави грициків на основні групи біологічно активних речовин використовували загальноприйняті методики, методи хроматографії: висхідній (ВБХ) і кругової (КБХ) на папері, а також, в тонкому шарі сорбенту (ТШХ). Для детектування хроматограмм використовували УФ-світло і хромогенні реактиви [5].

Проведення якісних реакцій на флавоноїди показало, що трава грициків містить флавоноїди переважно у вигляді глікозидів. Методом висхідній хроматографії на папері в системах БУВ 4: 1: 5 і 15% оцтової кислоти встановлено, що флавоноїдний комплекс грициків представлений 4 компонентами, один з компонентів ідентифікований зі свідком рутин [30].

Спектри поглинання етанольних витягів з трави грициків різної концентрації мали по два максимуму поглинання: mах = 265-270 нм і mах = 370-375 нм, що відповідає поглинанню флавоноїдів.

Всі компоненти флавоноїдного комплексу грициків забезпечують специфічний фармакологічний ефект. Тому надалі стандартизацію сировини та препаратів проводили за сумою флавоноїдів.

Спектри адсорбції з 2% -ним спиртовим розчином алюмінію хлоридом збігаються зі спектром поглинання комплексу рутина з алюмінію хлоридом і мають максимум поглинання при mах = 405 нм. Спектри поглинання компонентів флавоноїдного комплексу, зокрема діосметіна, мають максимуми поглинання близькі до рутину. Це дозволяє використовувати максимум поглинання комплексу рутина з алюмінію хлоридом в кількісному аналізі і розраховувати суму флавоноїдів на рутин-стандарт.

Використовувалася методика спектрофотометричного визначення суми флавоноїдів, заснована на визначенні оптичної щільності пофарбованого комплексу флавоноїдів з 2% -ним спиртовим розчином алюмінію хлориду.

Вивчені наступні стадії:

­ екстракція сировини етанолом різної концентрації;

­ умови реакції комплексоутворення з алюмінію хлоридом (таблиця 3.1);

­ умови кількісної екстракції флавоноїдів із сировини.

Таблиця 3.1. Вплив умов реакції та екстракції на вихід флавоноїдів

Вибір оптимальної концентрації етанолу проводили за даними хроматографічного аналізу, УФ-спектрами і експериментально по вмісту флавоноїдів в екстрактах залежно від концентрації етилового спирту. Оптимальним екстрагентом є 70% етиловий спирт.

На підставі отриманих результатів підібрані оптимальні умови аналізу: кількісна екстракція флавоноїдів із сировини досягається при використанні сировини зі ступенем измельченности частинок 1 мм, при триразовому по 30 хвилин настоюванні з 70% етанолом на киплячій водяній бані; співвідношень: сировини і екстрагента 1: 100, при масі сировини 0,5 г і обсязі екстрагента 50 мл; витягання і 2% спиртового розчину алюмінію хлориду в перерахунку на суху речовину 0,02: 0,06; стійкості комплексу в часі через 40 хвилин. Відносна помилка методу становить: ± 2,64 (таблиця 3.2).

Таблиця 3.2. Метрологічна характеристика методики кількісного визначення суми Флавонідів в траві Грициків звичайних

Вміст суми флавоноїдів в цільних зразках трави грициків, заготовлених в різних еколого-фітоценотичних умовах Харківської області та подрібнених зразках промислових серій коливається від 1,1210,02% до 2,48 ± 0,09%. Оцінка якості трави грициків за змістом суми флавоноїдів не менше 1%.

Таблиця 3.3. Динаміка накопичення флавоноїдів у траві Грициків звичайних